（一）、真菌病原物分离的程序
1．分离前的准备工作
分离和培养应该在无菌至少很清洁的条件下进行。
为了保证无菌操作，应注意下面几点：
1.1 清洁环境：分离工作严格说应在无菌条件下进行，无菌室或无菌箱是分离不可缺少的设施。
1.2 若限于条件实验只能在普通房间进行时，必须对房间进行彻底扫除，清洁环境、搞好卫生。地上多洒些水，以消除室内尘埃，工作台上铺好湿毛巾，点燃酒精灯。
1.3 分离工作开始前最好将所需的一切用品都准备好，放在超净工作台内或伸手可及的台外，以避免操作过程中频繁走动，破坏环境带来杂菌；
1.4 保证工作人员自身的洁净，工作前用肥皂洗手；
1.5 无菌操作前还要用70％酒精擦手；
1.6 工作中，特别在进行无菌操作时，呼吸要轻，不要说话等。
2．分离材料的选择
分离材料的选择对分离培养的成败有着决定的影响。
病害材料应尽可能新鲜，如可选择新近发病的植株、器官或组织作为分离的材料，可以减少腐生菌的污染。
最好在病、健交接处选材取样。病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。
从受害的边缘部分分离这一原则，对于绝大部分病害都是适用的。
采得的材料如已经败坏而沾染大量的腐生菌，有时可以采用接种后再分离的方法，即将沾染有腐生菌的病组织作为接种材料，直接接种在健全的植物组织工植株上，等发病后再从病株或病组织分离。先接种再分离的方法，用得较多的是植物病原细菌的分离。
3．组织的表面消毒剂
（1）酒精
用酒精（70%）消毒，只浸很短的时间（几秒钟到1分钟），然后用灭菌水冲洗；
较大的材料往往是在酒精中浸过后，或用棉花塞蘸酒精涂在组织表面，然后都在火焰上将酒精烧去。
（2）升汞溶液（0.1%）
配方为：升汞 1g， 浓盐酸 2.5mL， 加水 至 1000mL。
将升汞溶于浓盐酸中，待其充分溶解后，用水稀释。
升汞剧毒、无色，为便于认识，可在溶液中加几滴红染料。
消毒时间因材料质地、发病部位深浅及污染情况而异，一般3～5分钟。消毒后用无菌水冲洗3～4次。
（3）次氯酸钠NaClO3
由于漂白粉的成分不固定而影响其消毒效果，目前多改用次氯酸钠.
消毒所用的浓度一般是3%-5%的水溶液，消毒时间5-15分钟。
幼嫩的病组织，表面用药剂消毒时可能会同时杀死其中的病原真菌，消毒时间应尽量缩短。
比较安全的方法是不用药剂消毒，而以灭菌水洗8、9次。
4．常规分离方法
植物病原真菌的分离方法主要有两种：
组织分离法和稀释分离法。
组织分离法是最常用的方法.
稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。
植物病原真菌的组织分离的技术与步骤：
1）选取典型的病组织，在病健交界处将其剪成5mm×5mm的小方块若干，装于火焰灭菌的小碟中。
注: 选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。
2）向装有病组织的小碟中加入70%酒精（约半碟）进行表面消毒，十几秒后倒掉酒精。
注:先用70％的酒精浸2、3s是为了消除寄主表面的气泡，减少表面张力，70％的酒精亦用于表面消毒，处理的时间较短(一般数秒至lmin)。
3）向小碟中加入0.1%升汞或10%次氯酸钠溶液（约半碟）进行表面消毒，处理时间可自30秒至3分钟不等，然后倒掉废液。
注：升汞溶液消毒的时间因材料而异，可自30s至30min不等，如植物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之则可长些一般情况下，需时间3、5min。
4）向小碟中加灭菌水，冲洗3-4次（除去残留的消毒剂），将病组织转移到灭菌滤纸上吸去多余的水（以大大减少病组织附近出现细菌污染）。
5）将吸干水分的病组织移到预先倒好的PDA平板上，注意要用镊子轻压组织使其着靠在培养基上。
6）每皿5块，均匀摆放，倒置于25℃培养箱中培养。4-5天后检查结果。写明日期、姓名等。
（二）、真菌病原菌的纯化
对一种真菌在进行深入研究以前，菌种的纯化是必要的。此外，研究真菌的遗传和变异、性征和同宗或异宗配合等现象，都要求菌种从单个孢子（或小段顶端菌丝）繁殖而来。
1．菌丝块法
一般从形成的菌落的边缘挑取菌丝体移植培养，这也有一定的纯化作用。
2．单菌落法
将菌种上产生的孢子用灭菌水洗下，适当稀释后，取一定量的孢子悬浮液与熔化后冷却到45℃左右的琼脂培养基充分混合，倒平板培养，从形成的单个分散的菌落上移植菌丝体培养。
3．稀释法
将孢子悬浮液加适量的灭菌水，不断稀释到每一小滴悬浮液中大致只有1个孢子。
移植到适当的培养基上培养。
此方法操作比较麻烦，但是比前一种分离法可靠。
4．琼脂平板表面单孢子挑取法
孢子悬浮液中孢子调节到适当的数量，再涂匀在琼脂平板表面上。用玻璃针、金属针或其他器具在显微镜下观察和挑取。
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