民国初年，安琪儿剧团到北方某剧院演出。台柱演员孙小鸥在排练唱歌时，一反常态，屡唱不能合调。忽闻一阵悠扬歌声，正是自己屡试屡败的同一支歌。疑惑间，记起这座剧院出现怪异的传说，大骇，夺门而逃。守门老人告以怪异实情：若干年前，秋柳剧社来剧院演出，名伶宋丹萍与当地富绅李宪臣之女晓霞相恋，晓霞表兄汤俊追求晓霞不成，怀恨丹萍，用销镪水暗害丹萍。丹萍虽经业师鲍笑天相救未死，但面容全毁，狰狞可怖。他不忍使晓霞伤心，谎称已死。岂料晓霞一往情深，闻噩耗后精神失常。李宪臣认为女儿此举有辱门庭，迁居他处，留一老妇照料晓霞。丹萍闻知，后悔鲁莽，秘密贿赂守门老人，潜居于剧院顶层，与晓霞居室咫尺相望，每当月夜，常以悲歌相慰。小鸥闻知其事，深为同情。演出之日，小鸥演唱成功，名声大噪，感宋丹萍指教之恩，循声往谢，遂成知己。丹萍见小鸥相貌与己酷似，求其着昔日衣装冒名去会晓霞。晓霞不疑，病情渐愈。时安琪儿剧团因营业不振，准备易地演出。丹萍竭力挽留，并将当年盛极一时的名剧传授小鸥。开演之日，观众满座。小鸥恋人女演员绿蝶在幕侧以热吻祝贺小鸥演出成功。适汤俊在场观剧，垂涎绿蝶貌美，擅入后台化装室欲加非礼，与小鸥发生殴斗。绿蝶为掩护小鸥，被汤俊枪击殒命。正当小鸥危急之时，丹萍自幕顶跃下，将汤俊逼上剧场楼顶，使汤俊失足坠楼身亡。围观群众不明真相，将丹萍视作魔怪逼至顶楼。丹萍见大仇已报，纵身投入江流。
《夜半歌声》插曲 演唱：杨洪基
空庭飞着流萤，
高台走着狸鼪，
人儿伴着孤灯，
梆儿敲着三更。
风凄凄，
雨淋淋，
花乱落，
叶飘零，
在这漫漫的黑夜里，
谁同我等待着天明？
谁同我等待着天明？
我形儿是鬼似的狰狞
心儿是铁似的坚贞
我只要一息尚存
誓和那封建的魔王抗争
啊！姑娘
只有你的眼
能看破我的生平
只有你的心
能理解我的衷情
你是天上的月
我是那月边的寒星
你是山上的树
我是那树上的枯藤
你是池中的水
我是那水上的浮萍
不！姑娘
我愿意永做坟墓里的人
埋掉世上的浮名
我愿意学那刑余的史臣
尽写出人间的不平
哦！姑娘啊
天昏昏
地冥冥
用什么来表我的忿怒
惟有那江涛的奔腾
用什么来慰你的寂寞
惟有这夜半歌声
惟有这夜半歌声
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