双酶切的注意事项

Question

如题所述

Answer 1

1、 做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见，一般连接3小时，16度。
2、 对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干。
3、 对照的设立：为验证双酶切是否成功，可做如下对照：
酶切反应时加各单酶分别切，两管，用同一种BUFFER，跑胶，看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.做转化时，也要进行对照。