在pcr实验中,引物的设计一般有哪些要求

Question

如题所述

Answer 1

引物设计原则：
长度: 18~30 bp, 20 bp左右最为常用。引物过短易导致非特异性打增；较长引物特异性强，但退火效率低，且易形成二级结构，从而导致PCR产量少。
二级结构:引物二聚体及发夹结构的能值过高(大于4.5 kcal/mol )易导致产生引物二聚体带，并且降低有效引物浓度，使PCR反应不能正常进行。
引物扩增跨度: 200-3000 bp，特定条件下可扩增至10kb的片段；而实时荧光PCR较短，为70-150 bp。
引物GC:含量40-60%为宜，太低会生成不稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率，过高时解链所需能量高，难以打开。
引物的特异性:引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%。
碱基分布: ATCG要随机分布，避免出现重复序列，如-CCAG-CCAG-CCAG-重复序列；避免单条引物或多条引|物间互补；避免单个碱基连续重复4次以上。
熔解温度Tm :最佳为55-60 °C , 引物对之间Tm差异不超过2-3°C，如差异过大，扩增效率将大大降低。