1953年7月7日，格瓦拉开始了他的第2次拉美之旅。在玻利维亚经历了一次革命之后，格瓦拉从厄瓜多尔前往危地马拉。途经哥斯达黎加时，这个当时拉美唯一的民主国家深深打动了格瓦拉。1953年12月24日，格瓦拉到达了危地马拉。当时危地马拉正处于年轻的左翼总统阿本斯（Arbenz）的领导下，进行着一系列改革，尤其是土地改革，矛头直指美国联合果品公司。在危地马拉，格瓦拉结识了许多由于反抗独裁统治者而被迫流亡的革命者，其中有秘鲁女革命者伊尔达·加德亚（后来在墨西哥，她成为了格瓦拉第一任妻子）。格瓦拉与这些革命者一起投入保卫阿本斯政权的斗争，积极为阿本斯民主政府服务。
格瓦拉得到了他知名的绰号切”（Che）“Che”是一个西班牙语的感叹词，在阿根廷和南美的一些地区被广泛使用，是人打招呼和表示惊讶的常用语，类似于汉语中的“喂”、“喔”等。1954年2月12日，在给姑妈贝阿特丽斯的信中，格瓦拉第一次坦率地承认他与危地马拉的共产党人有联系。1954年3月28日，美国中央情报局在洪都拉斯成立了一支由危地马拉军官阿马斯领导的雇佣军，准备颠覆阿本斯政权。1954年6月，武装到牙齿的阿马斯的雇佣军（共有800人，其中200人是危地马拉人）入侵危地马拉。6月27日，阿本斯总统被迫辞职。阿本斯政权被颠覆后，阿马斯成为危地马拉总统，开始对左翼人士进行残酷地镇压，几个月之内约9000人被捕或被杀害，格瓦拉也上了美国中央情报局的黑名单。危地马拉的革命经历使格瓦拉认识到：要用医道去造福人类，必须首先发动一场革命，推翻反动独裁统治。在墨西哥并在此结识了菲德尔·卡斯特罗和劳尔·卡斯特罗。 1959年格瓦拉被授予“古巴公民”的身份。1959年5月22日，格瓦拉同自己的第一任秘鲁裔妻子伊尔达·加德亚（Hilda Gadea）离婚，他们唯一的女儿由格瓦拉抚养。6月，格瓦拉同参与了古巴革命且与自己志同道合的阿莱达·马奇（Aleida March）结婚，之后他们共育有4个子女。
格瓦拉被任命为卡瓦尼亚堡军事监狱的检察长，负责清除巴蒂斯塔时代的战犯（主要是政客和警察），一些资料认为格瓦拉处死了156人，但一般认为，人数可能高达600。1959年10月，格瓦拉被任命为国家银行行长，开始对古巴经济体制进行社会主义改造，将企业收归国有，并实行了土地改革。1961年，格瓦拉又被任命为工业部长。格瓦拉帮助卡斯特罗在古巴建立了社会主义制度，在古巴遭到美国经济封锁后，格瓦拉与苏联签定了贸易协定。在这段时间内，他也因为其对美国的强硬态度而逐渐闻名于西方。在古巴导弹危机中，他是1962年赴莫斯科谈判的古巴代表团的成员之一，并最终签署了苏联在古巴部署核武器的计划。格瓦拉认为，安置苏联的导弹将捍卫古巴独立，使古巴免于遭受美国的侵略。
1964年12月，格瓦拉代表古巴出席联合国第19次大会，之后相继访问了阿尔及利亚、刚果(金)等8个非洲国家和中华人民共和国。当1965年3月14日回到古巴后，他与卡斯特罗在诸如对苏关系、援助第三世界革命等问题上的分歧日趋严重。不久他辞去了自己的职务，4月1日他乘飞机离开了古巴，前往刚果（金）。在古巴担任高官期间，格瓦拉抵制官僚主义，生活节俭，并且拒绝给自己增加薪水。他从没上过夜总会，没有看过电影，也没去过海滩。一次在苏联一位官员家里做客时，当那位官员拿出极昂贵的瓷器餐具来招待格瓦拉时，格瓦拉对主人说：“真是讽刺，我这个土包子怎么配使用这么高级的餐具？”同时格瓦拉周末还积极参加义务劳动，比如在甘蔗地或工厂里劳动。 1965年4月23日，格瓦拉从坦桑尼亚穿越坦噶尼喀湖前往刚果。在之前他同卡斯特罗的一次秘密会谈中，格瓦拉说服了卡斯特罗支持这次行动。在最初他得到了当时刚果游击队领导人洛朗-德西雷·卡比拉（Laurent-Désiré Kabila）的协助，但不久格瓦拉拒绝了他的帮助，认为其是完全无意义的，并写到：“没有什么能让我相信他是一个现在的人”。格瓦拉向刚果起义军队传授游击战术，他的计划是利用刚果坦噶尼喀湖西岸的解放区作为基地，训练刚果及周边国家的革命武装。此时格瓦拉已经37岁，而且并没有受过正规军事训练的经验（他的哮喘使他免于在阿根廷服兵役），他的战斗经验大都来自古巴革命。
与刚果政府军一道的美国中情局人员，此时正全程监控格瓦拉部队的对外通信，以便于在格瓦拉的游击队来袭前能先发制人、截断其补给线。格瓦拉在此役所期许的是能够向当地的辛巴人灌输古巴共产主义革命思想及游击战术，将他们训练成一批骁勇善战的游击队。事后格瓦拉在他的《刚果日记》里回忆，当地人组织起来的乌合之众愚笨、漫无纪律、内部纷争不休是导致这次起义失败的主要原因。同年，在非洲丛林吃足了7个月的苦头之后，病弱的格瓦拉沮丧地与他剩存的古巴战友离开刚果（有6个伙伴没能活着离开）。格瓦拉一度考虑将受伤士兵送回古巴，自己留在刚果丛林里战到最后一刻，用生命为革命竖立典范。不过，在几次徘徊后，格瓦拉经不住同志们的苦苦哀求，同他们一起离开了刚果。离开刚果的格瓦拉并没有因此回到他熟悉的古巴。在卡斯特罗公布的格瓦拉道别信里，格瓦拉宣称他将切断与古巴的一切联系，投身于世界其他角落的革命运动。为此，格瓦拉深觉在道义上他不应回古巴。接下来的六个月里，格瓦拉极其低调地游走于坦桑尼亚首都达累斯萨拉姆、布拉格以及东德。这段时期，格瓦拉除了记载他在刚果的经过外，还开始起草两本书，准备对经济学及哲学加以论述。在卡斯特罗获悉格瓦拉的下落后，极力要求他的老同志回到古巴。格瓦拉则明确地声明，除非是为了在拉丁美洲国家进行革命活动，因地利之便，他会在绝对机密的情况下回到古巴进行筹备工作外，他将不再踏上这片土地。
1967年10月在玻利维亚拉伊格拉，格瓦拉游击队中的一个逃兵向玻利维亚特种部队透露了格瓦拉游击队的营地。10月8日，当格瓦拉在拉伊格拉附近带领巡逻，特种部队包围了营地并且捉住了他。他在他的腿受伤后投降。关于他被擒时的情景分别有几个版本，有说法在冲突期间，有几个士兵想接近他，他便喊道：“不要射击！我是切·格瓦拉，我活着对您来说比死更有价值”。另一说法是他被捕获时身份仍然不为人所知。他在捕获之时佩带著一只刚收到的礼物劳力士手表。巴里恩托斯总统知道他被擒后，马上下令处死他。格瓦拉被囚在一个破落的校舍一夜后，第二天下午他便在他的手被绑在板上的情况下被一个抽签抽到了短秸秆的玻利维亚陆军中士枪毙了。一些人认为那个中士是向格瓦拉的面和喉头开枪。被广泛认同的是，他开枪射格瓦拉的双腿以令他的面孔完整以便证明身份，并假装是作战的创伤以隐瞒他被枪毙。处死他的是政府军的一位中士（这个中士后来2007年在古巴通过医疗福利系统治疗了白内障）。他喝了一点酒壮胆后进入房间，坐在椅子上的格瓦拉站了起来。中士命令他坐下，格瓦拉却说：“我知道你要在这里杀死我。开枪吧，胆小鬼，你要杀死的，是一个男子汉！”中士有些生气，直接举起枪打向格瓦拉的胸膛。另一个版本是在行刑前刽子手颤抖着不敢开枪，格瓦拉平静地对他说：“开枪吧，胆小鬼，你只是要杀死一个人而已。”他的尸体被直升机送到了一个地方医院并展示给媒体。关于他的遗体的照片成为了一个传奇，当地修女认为他的样子很像耶稣。在一名军医切断了他的双手之后，玻利维亚的陆军将校将格瓦拉的尸首转运去一个秘密地方，并拒绝透露他的遗骸是否已被埋没或火化。但是 第一种说法明显的问题在于费利克斯·罗德里格斯是在三天后才达到玻利维亚的，所以其根本不可能听到所谓格瓦拉投降的话语。 格瓦拉等人的遗骨被运回古巴后，暂时停放在哈瓦那的何塞·马蒂纪念馆内。1997年10月9日（即格瓦拉遇难30周年），古巴国务委员会发出通知，确定当月11日至17日为国丧日，并确定将格瓦拉的遗骨以国葬的规格安葬在他生前战斗过的圣克拉拉。
古巴政府为格瓦拉举行了最为隆重的悼念活动和安葬仪式。1997年10月10日古共五大闭幕后，悼念活动相继展开。14日，格瓦拉遗骨移送圣克拉拉。当天，哈瓦那通往圣克拉拉的公路实行管制，任何闲杂车辆不得通行。圣克拉拉数十万群众涌向灵车经过的路旁，灵车经过之处撒满鲜花，场面十分感人。17日上午9时，安葬仪式开始。格瓦拉的遗骨被安放在格瓦拉广场中，同时被安葬的还有6名游击队员的遗骨。卡斯特罗在葬礼上发表讲话，颂扬格瓦拉对古巴革命的杰出贡献，称赞他是革命者和共产党人的楷模。葬礼结束时，卡斯特罗亲自点燃了格瓦拉灵前的长明灯。 2014年11月，切·格瓦拉遭玻利维亚军队杀害47年之后，一批他被枪杀当时的照片首度曝光。
