某一同学克隆了一个基因的编码cDNA序列，为了研究其性质，欲构建其表达重组质粒，请你为他列出一个实验方案

Question

如题所述

Answer 1

1.根据实验需要选择合适的表达载体。
要考虑的问题：
使用什么样的启动子？要不要与报告基因组成融合蛋白？有没有纯化蛋白的考虑？
2.根据表达载体的多克隆位点选择合适的限制性内切酶位点，确保cDNA序列中没有这些位点。
3.设计带有这些酶切位点的PCR引物，以cDNA为模板，扩增其编码序列（从起始密码子到终止密码子的部分）
需要绝对注意的问题：如需表达融合蛋白，切记不能让插入片段（报告基因在前）或插入片段以后（报告基因在后）的序列发生移码。可通过在引物上添加补齐碱基来解决。
其它需要注意的：引物5‘端至少加3个保护碱基，否则下一步无法进行。
4.PCR产物和载体质粒同时用对应限制性内切酶进行切割，回收酶切产物。
5.插入片段和线性化载体按3：1的比例，使用T4DNA连接酶进行连接。4度过夜。
6.连接产物转化大肠杆菌，涂对应抗生素LB平板。37度培养过夜后，挑取单克隆菌落接入少量含抗生素的LB培养基，37度摇床上培养过夜。
7.收集菌液中的菌体，抽提质粒。得到的质粒用同上的内切酶进行酶切，酶切产物跑琼脂糖电泳进行鉴定，能切出大小符合要求的条带者保留。
8.将保留的质粒测序，插入片段与原cDNA序列相比无突变者即需要的重组质粒，可进一步扩大培养。

Answer 2

你要告诉大众，你的基因功能如何，然后是什么物种，适合什么转基因方法，然后通过转基因验证其功能。

Answer 3

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