构建重组质粒时并不是只用同种限制酶切割目的基因和载体，虽然理论上本应如此，一般都用同种才会容易处理，但常见的也有将两种限制性内切酶，也就是不同的限制酶进行双酶切，最后也会产生互补的黏性末端。其实用同一种限制酶，也就是单酶切，去分别切割目的基因与运载体这种方法是最简单。如果用传统酶切连接法，只要片段两端黏性末端相同就没问题，所以可以用同一种酶，分别用同两种酶，也可以用黏性末端相同的不同酶或者切平末端。切割后能产生相同的黏性末端，末端彼此间可以发生碱基互补配对，从而形成重组DNA分子。所以当用两种不同限制酶也就是双酶切，分别切割含目的基因的DNA片段和质粒，能够防止发生目的基因与质粒自身连接体，充分克服单酶切的缺点。但由于每种限制酶作用的条件不同，两种酶不能同时使用的意思，只是为了保证酶的高效性。复杂的双酶切操作可以用T载体连接，目的基因只需用合适的Taq酶PCR就足够，自然会留下A末端去连接载体上的T末端。如果是Gibson法一类的无缝重组法，目的基因也不需要切，只需要两端同源或者特定序列足够就行。 双酶切可以防止自连，并确定方向，这种切割方式可以分为三种情况。第一种是type II S 型限制酶，其识别位点和切割位点间彼此会有一段距离，可以构建出类似双酶切的效果。然而一般的 type II 型限制酶，连接完后需要挑选出正确连接的克隆，包括是否空载自连、片段拷贝数和片段方向。第三种情况可以用碱性磷酸酶去磷酸化，降低自连概率。
