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pcr技术引物与退火温度
pcr的
技术
的主要步骤及
pcr引物
设计的一般原则有哪些
答:
PCR的技术的主要步骤:1、DNA变性:(90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA。
2、退火:(60℃-65℃):系统温度降低
,引物与DNA模板结合,形成局部双链。3、延伸:(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右,活性最佳)的作用下,以dNTP为原料,从引物的3′端开始以从5′→3...
为什么
pcr退火温度
高,结果特异性强,退火温度低非特异多?
答:
退火温度越高,断开氢键的热能越大,引物与模板越不易结合,反之,退火温度越低,越容易形成氢键,进行退火
。所以当温度高时,只有碱基匹配程度高的,也就是模板与引物形成配对数越多的引物,才能结合到模板上,这样扩增出来的条带最少,甚至只有一条,也就是引物和目的序列的完美匹配, 因此特异性越高。
做
pcr
,如何确定最佳
退火
及延伸的时间
和温度
?
答:
退火温度根据引物来决定
一般先用55° 不行的话再往下降
PCR
反应
温度
怎么设置?
答:
在
pcr
反应过程中,要使用三个不同的
温度
变化,有变性,
退火
,扩增三个不同的反应阶段,而这三个反应需要的最适温度不同。具体设置如下:1、变性反应温度的设置 当温度控制在90 °C以上时DNA会发生变性,双链DNA解链成单链。2、退火反应温度的设置 当温度下降到50 °C的时候,DNA复性,两种
引物
通过...
pcr
过程中
退火温度
是什么决定的
答:
55℃为选择最适退火温度的起点较为理想.另一种说法:熔解温度(Tm)是引物的一个重要参数.这是当50%的
引物和
互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定
PCR退火温度
是必需的.在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火,同时还要足够高,以减少非特异性结合.合理的退火温度从55℃到...
pcr退火温度
怎么确定?
答:
熔解温度(Tm)是引物的一个重要参数。这是当50%的
引物和
互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定
PCR退火温度
是必需的。在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火, 同时还要足够高,以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。设...
为什么在
PCR
反应过程中,使用三个不同的
温度
变化
答:
第一个一般在94-95度左右,叫做变性,就是通过加热打开双链。第二个
温度
点叫做
退火
,根据
引物
的TM算出,一般比TM低5度,有利于引物的结合。第三个温度叫做延伸,一般采用72度。是引物结合后DNA聚合酶按照模板合成新的链。一分钟一千个碱基对。如此循环。现在很多
PCR
都采用2部法,由于采用了不同的DNA...
pcr技术
中需要添加的
引物
有几种
答:
PCR技术的主要步骤如下:1、dna变性:(90℃-96℃):在热作用下,双链dna模板的氢键断裂,行程单链dna。
2、退火:(60℃-65℃)
:体系温度降低,引物与dna模板结合形成局部双链。3、延伸:(70℃-75℃:以dntp为原料,在taq酶的作用下(72℃左右),以dntp为底物,从引物的3′端开始,从5′→...
PCR
反应
退火温度
的高低与什么因素有关
答:
退火温度
是影响
PCR
反应特异性的重要因素。
引物与
模板复性所需要的退火温度取决于引物的长度、碱基组成及其浓度。引物长度越短,引物中G+C的含量越低,所需的退火温度越低。虽然降低退火温度可能增加扩增产量,但引物与模板间的错配现象也会增多,导致非特异性扩增上升。相反,提高退火温度虽然可以提高反应的...
何谓PCR?
PCR引物
设计时有哪些注意事项(注:要考虑
退火温度
)?一条PCR引物...
答:
②
引物
长度 ② GC含量,一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%,一对引物的GC含量和Tm值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。③
退火温度
退火温度需要比解链温度低5℃,如果引物碱基数较少,可以适当提高退火温度,这样可以使
PCR
的特异性增加...
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