关于PCR产物酶切

Question

要构建一个载体
目的基因PCR回收后做双酶切
应该做多大的体系
50 or 100？
各种成分为多少？
望大家不吝赐教！
谢谢！

Answer 1

做双酶切首先要确定两个酶使用的buffer是否相同，可以到酶供应商的网站上查询（NEB,MBI,TAKARA等） NEB的双酶切表 http://img.dxy.cn/upload/2006/08/13/31219184.pdf
。

同步双酶切
同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。

2、分步酶切
如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。

具体的你看 百度百科 http://baike.baidu.com/view/1380500.htm

反应体系的话酶供应上岁产品会给相应的建议。体积多大要看个人实验所需，如果下游实验需要DNA的量很大那建议使用100ul的，如果需要的没有那么多，使用25ul或50ul也就够了。

参考资料：http://baike.baidu.com/view/1380500.htm

Answer 2

双酶切体系做10微升就行了.Buffer 1，双酶切的两种酶各 1 ，PCR回收产物7，就可以了．
构建载体：连结体系：Buffer 1，载体 1，T4连结酶 1，双酶切回收产物 7．